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| 圖片來源/好心肝會刊 |
基因編輯技術——CRISPR/Cas9是十分重大的發現，被譽為是能夠精準切割DNA的神奇剪刀，除開啟基因治療的大藍海，也為根除B型肝炎帶來新契機，國內學者進行相關研究已有進展！
文，黃秀美（健康專欄作家、名醫一點通 • 健康網 主筆）、黃靜宜
DNA是生命的藍圖，當藍圖出錯時，如果能夠精準找到出錯的部份，把有問題的片段剔除或校對，或許就有機會能夠治癒疾病。但人體 DNA 鹼基序列有 65 億個，要找到目標DNA（target DNA）片段，並精準切割，有如大海撈針，談何容易？
CRISPR/Cas9切割DNA
從細菌獲得的靈感
2020年諾貝爾化學獎頒給美國生物化學家道納（Jennifer Doudna）和法國微生物學家夏彭提耶（Emmanuelle Charpentier），就是因為她們於2012年發表的基因編輯技術CRISPR/Cas9易於操作，透過設計一段短片段的引導RNA（guide RNA, gRNA) ，就可以精準地辨識及切割目標 DNA，讓透過基因編輯去治療疾病的可行性大為提高。
CRISPR/Cas9透過設計一段短片段的引導RNA（guide RNA, gRNA）， 就可以精準地辨識及切割目標 DNA 。 被切割斷裂的DNA會有修復機制，但常不精準，所以會造成切割處的基因失去功能（這機制常被用來剔除特定基因功能），但也可同時送入一段正確基因去進行正確修補，達到基因編輯矯正突變基因的目的 。
CRISPR全名是clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats，字面上的意思是「叢集有規律間隔的短迴文重複序列」。
1987年日本科學家在大腸桿菌的基因組發現有特別的規律序列，某一小段DNA會一直重複，重複片段之間又有相等長的間隔，此序列就稱為 CRISPR，而Cas9全名為CRISPR associated protein 9，則是細菌裡一種會去切割DNA的酵素，它會辨認出外來的DNA，切下其中一個基因片段收藏起來，等這外來的DNA下次再出現，細菌就可以迅速辨識出予以消滅，可說是細菌後天發展出的適應性免疫系統。
要治癒B型肝炎 消滅cccDNA是關鍵
目前慢性B型肝炎只能藉由干擾素或口服抗病毒藥物來抑制病毒複製，達到血液中測不到B肝病毒的效果，但無法治癒，主要是因為肝細胞裡面還躲藏著具有複製能力的B肝病毒共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）。一個受B肝病毒感染的肝細胞裡，約可躲藏著30個到50個具有複製能力的cccDNA，可說是B肝病毒複製的模板，一旦停藥或免疫力下降，cccDNA就可能再度活化，複製大量B肝病毒，興風作浪。
科學家想到，是否能活用基因編輯技術CRISPR/Cas9，精準切割B肝病毒之cccDNA，讓已經存在受感染肝細胞內的cccDNA大幅減少或甚至是完全消失，達到根治B型肝炎的目標？
2014年楊宏志教授等人發表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》期刊的研究，就是利用CRISPR/Cas9來精準切割cccDNA，並且也證實在B型肝炎小鼠動物模式中可行。但是人體感染B肝病毒後，肝細胞內不只有攆不走的cccDNA，在肝細胞的基因體內，還嵌入了B肝病毒去氧核醣核酸（integrated HBV DNA），integrated HBV DNA雖然沒辦法形成完整的B肝病毒序列，因此不像cccDNA會一直複製出B肝病毒顆粒，卻有可能會不斷製造出B肝表面抗原（HBsAg），干擾B肝表面抗原的清除。
CRISPR/Cas9在切割cccDNA的目標DNA時，也會切割integrated HBV DNA，聽起來似乎是一石二鳥的妙計，但卻會導致宿主DNA雙股斷裂的後果，在修補的過程中，有可能會增加癌化的風險，等於解決一個問題時，可能又同時創造另一個新的問題，有安全上的疑慮。
採用新一代基因編輯工具
化解致癌危機
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於是楊宏志教授等人在2020年發表的研究中，改為使用新一代的Cas9鹼基編輯工具，簡稱Cas9-BE，這個工具把原本負責切割DNA的Cas9酵素去活化，接了一個新的APOBEC 1酵素（apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide 1），這個新的酵素可以進行基因鹼基編輯。
在生物學上，DNA有A、T、C、G四種鹼基。APOBEC 1酵素可以把DNA的四個鹼基中的C編輯成T，而在與之互補的對股上會把G編輯成A。如此就能讓cccDNA、integrated HBV DNA壞掉而失去活性，即使不切割DNA，也能達到讓B肝病毒無法複製、表面抗原（HBsAg）也被破壞的目標，因此，也就不會造成宿主基因的雙股斷裂，讓基因編輯用於治療B型肝炎上的安全性大為提高。
利用LNP包裹，有效遞送到肝臟
而運用在臨床上，最大的挑戰是能不能有很好的運輸系統，把要遞送的基因編輯工具以messenger RNA（mRNA）的形式加上引導RNA順利精準的運送到肝細胞，才能發揮功能。
科學家常使用一種腺相關病毒，利用病毒會感染人體的特性，把基因編輯工具送進細胞內，但使用病毒要考慮會不會引發人體的免疫反應，以及病毒DNA會不會嵌入人體基因等，所以在B肝研究中是使用脂質奈米顆粒（lipid nanoparticle, LNP）。
而採用LNP包裹Cas9 mRNA去進行人體基因治療疾病，已在一種「類澱粉沉積心肌病變」（簡稱AATR）上獲得驗證。AATR的臨床試驗刊登在2022年《新英格蘭醫學期刊》（The New England Journal of Medicine, NEJM），以基因編輯技術CRISPR/Cas9所製造的新型藥物NTLA-2001，以LNP包裹後，透過靜脈注射經由血液循環遞送到肝臟，進而編輯肝細胞的異常TTR蛋白。該臨床試驗有6位患者被納入，所有患者均完成治療，血清 TTR 蛋白濃度持續降低，且沒有觀察到嚴重的不良事件。
肝臟本來就是脂質代謝的標的，因此，把要遞送的基因編輯工具及mRNA先以LNP包裹，再透過靜脈注射的方式，可經由血流到達肝臟。理論上注射多次，就有機會讓肝細胞內絕大多數的cccDNA、integrated HBV DNA喪失活性。楊宏志教授等人的研究已證實在細胞試驗上可行，接下來打算進行動物試驗，以感染B肝病毒的小鼠進行研究，盼能達到根除B型肝炎的希望。
需避免基因遭到意外修改 強化安全性
利用基因編輯治療B肝，優點是可直接針對病毒cccDNA及integrated HBV DNA，使其不活化，等於是釜底抽薪的辦法，可達到徹底根除的可能性，但是還有一些需要克服之處。
除了有效性外，降低脫靶效應（off-target effects）一直是基因編輯治療中必須重視的一大關鍵課題。脫靶效應指的是在進行基因治療時，意外修改了不應改變的基因片段，因有可能會造成人體不可預期的傷害，所以不希望發生，尤其B型肝炎目前已經有不錯的干擾素及口服抗病毒藥物可以有效控制病情，因此基因編輯治療的安全性需要多方確認，否則也不急於用在B型肝炎的根除治療上。同時，由於B肝病毒有很多基因型，是否能挑到一種好的gRNA，能夠適用於各種基因型的B肝病毒，會是另一個挑戰。
此外，研究人員發現，人體感染B肝病毒後，嵌入的integrated HBV DNA也常是插在致癌基因（oncogene）旁，且常會造成端粒酶的高度表達。端粒酶的作用是可讓細胞延遲老化，所以腫瘤細胞一定有端粒酶，肝癌細胞也不例外。雖然透過基因編輯方式可讓integrated HBV DNA不活化、B肝表面抗原不再製造，但integrated HBV DNA仍在，它本身就是致癌基因，也可以活化旁邊的基因，因此，藉由基因編輯，有沒有可能治癒B型肝炎的同時也降低肝癌風險？也是接下來要繼續努力的目標。
諮詢專家
楊宏志醫師
臺大醫學院微生物學科教授、臺大醫院內科部主治醫師
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